微课干货│多重PCR技术在NGS领域中的应用

A：多重PCR体系能够兼容复杂的扩增体系，可以直接用裂解产物就可以进行多重PCR；FFPE样本也可以；Quick-seq主要步骤：先裂解样本15分钟，然后取适量样本进行第一轮特异性PCR（30-60min），纯化（30min），再进行一轮通用PCR（30-60min），最后纯化（30min），得到上机文库；

A：Taq 酶的错误率 大约2.7x10-4，高通量测序的错误率大概是3-5x10-3，Taq酶的错误率比高通量测序低一个数量级，因此对于普通的检测需求，Taq酶的错误率其实不会太影响高通量的测序结果。对于司法个体识别和无创亲子鉴定，不需要100%的SNP位点都检测准确，只要保证错误率在一定的范围内就可以。

A：多种样本都可以不进行DNA提取，包括血液、唾液、组织、血片、头发、精液、FFPE、骨头、尿液、表面擦拭物等。

A：多重PCR会出现ADO的现象，主要的原因有：a. 模板的投入量，b.引物设计位置上存在SNP，c. PCR扩增的bias；对于普通的多重PCR，当投入的拷贝数大于100个时，这种ADO出现的概率是很小的，而对于单细胞的多重PCR，这个ADO的概率大概是30-80%。

A：Quick-seq平台可以定制化设计科研和临床检测方面的应用，科研主要是针对16S和ITS宏基因组，临床方面就是特定病源微生物的检测，目前没有现成的标准化试剂盒，我们可以提供定制化的产品服务，可以在1-2个月内完成产品的交付。

A：探针捕获技术适合区域大于1M的panel，而多重PCR适合区域小于1M的panel；探针捕获实验操作复杂，周期长，而多重PCR操作简单，周期短；探针捕获要求的起始量高（>200ng)，而多重PCR要求起始量低(>1ng)；多重PCR适合目标明确，区域不大的应用，如靶向用药，而探针捕获适合大范围的寻找可能的致病源，如罕见病检测；对于临床来讲，多重PCR技术在实验操作和周期上更适合医院的落地。

A：甲基化目标区域测序是通过多重PCR对重亚硫酸盐处理后的模板进行捕获的，这个多重PCR技术比较特殊，其最大的特点是有效抑制了不同引物对之间的引物二聚体并且大幅度提高了引物的特异性。

A：可以的。对于基因的融合，一般是在RNA水平上进行检测，而扩增和点突变等是基于DNA水平上检测的。一般情况下融合和扩增、点突变需要分别根据RNA和DNA建两个靶向文库，然后在混合在一起进行测序，而我们针对肿瘤开发的热点突变试剂盒可以一次建库中完成RNA和DNA两种靶向文库的制备。

A：不同来源样本采用相同试剂盒抽提好的DNA进行PCR，其多重PCR扩增的效率差别很小,如果是采用样本直接扩增，其多重PCR扩增效率差别会很大； DNA模板、引物和DNA酶形成起始复合物才能触发DNA的延伸，不同酶对相同模板和引物的形成起始复合物的效率是有差异的，这种差异一般是由于酶中和引物与模板结合的结构域差异导致，而不同的酶这种结构域的结构是有差异的，因此会出现使用不同的聚合酶导致生成引物二聚体的量不一样。

A：我们不做服务，而是提供靶向测序模块化的产品和整体解决方案。华大智造致力于打造行业领先的核心测序平台，针对于靶向测序有一个定制化产品平台：联合多个公司，采用多种技术，针对不同的应用方向，提供多种靶向测序方案。技术平台覆盖DNA、RNA和甲基化，提供从产品设计、实验操作、测序、分析到报告的整体解决方案。目标客户是医检所、提供基因检测服务的公司、科研院所等。